（来源：小张聊科研 小张聊科研）

国自然项目和稍微好一些的文章中都有一个必备的实验——挽救（Rescue）实验，也有人叫回复（Recovery）实验，相信大家多少都听到过或者知道。其实在10年以前，我就写过一篇推文：（策略篇）S5E56: 大名鼎鼎的Rescue挽救实验，是个什么鬼？

在这篇推文中，大致分成了单因素和多因素、功能和机制挽救这两类，现在看起来还是很“肤浅”的。随着对科研认知的提升，这个版本需要升级了。下面从研究的逻辑角度阐明挽救实验背后的逻辑以及必要性。

1. 为什么基因干扰后要做过表达的“挽救实验”？

一般研究的场景是：为了研究A基因的功能，通过shRNA（siRNA）设计靶向A基因的干扰序列，并且通过qPCR和WB验证了干扰效率，然后通过一系列功能实验发现A基因干扰后，抑制了疾病相关的细胞与动物的表型，从而得到的结论是：A基因促进疾病的某个表型。

如果我们习惯了这样的思路和结论方式，并不觉得有什么问题，但是（至少）有两个问题导致这个结论有问题（不严谨）：

1）A基因干扰后抑制了疾病相关表型，直接的结论应该是抑制A基因可以改善疾病相关细胞与动物表型，而非A基因促进疾病相关表型，后面促进疾病表型的作用应该用A基因过表达或者激活来说明。

需要注意的是：虽然在很多研究中，A基因沉默和过表达的功能是相反的，但并不绝对。前提条件是A基因的功能随A的表达量增加而增强，例外如：A基因发挥功能存在一定的阈值，如在（0-100）的表达量内，功能随A表达量的增加而增加；当超过100后，A基因的功能则进入平台期、下降、甚至出现另外一个表型（超过100后的机制，与<100的机制不同）。

所以，为了证明A基因的功能，还需要做A基因的过表达，以完整证明A基因的功能。只是医学和生物学的很多操作很难对A基因的表达进行精准控制（多数技术都是半定量的方式），比如几乎很难精准控制A基因的表达量为0.1，1，10，100，1000等。

2）由于技术的“非精准靶向”造成的问题：不管是shRNA（siRNA）还是sgRNA（CRISPR-Cas9），不可避免的一个问题是脱靶效应，即“我的目标是抑制基因A，但是不可避免的会靶向B、C、D等基因，从而导致B、C、D等基因表达也下降”，那么我怎么能确定shRNA处理后的作用，是A基因被抑制导致的，还是因为脱靶效应后B、C、D等基因下降造成的呢？那就需要在靶向A的shRNA组进行A的过表达，看“因为A下降”造成的表型能不能因为A的过表达来回复。因此，在文章中经常有审稿人就这个问题提出质疑。

其实严格说起来，shRNA靶向的是A的RNA（和蛋白），当我们说A“基因”的时候，指的是A的DNA（这里有偷换概念的问题）。因此这里还有个前提：当时我们说A“基因”发挥功能的时候，我们默认的是A的DNA通过A的shRNA和蛋白发挥作用，问题是A的DNA发挥功能的方式≠A的RNA（和蛋白）发挥作用的方式，比如A的DNA可能作为调控元件以机制1的方式发挥功能，A基因转录出的RNA以机制2的方式发挥功能，而蛋白则以机制3的方式发挥功能。因此要说“基因”A发挥功能，还要考虑CRISPR-CAS9的手段，把序列敲除（DNA层面）、再结合RNA干扰（RNA和蛋白层面）、以及单纯蛋白层面的干预手段（如PROTACs）以确认表型的一致性，从而保证结论的严谨。

当然，上面的这两个问题反过来思考，也可以作为国自然基金中的分子机制的创新，你看是不是就跳出了“套路”？